Meloksykam jako inhibitor glikacji – nowe możliwości terapeutyczne

Meloksykam – czy inhibitor glikacji to przyszłość leczenia?

Meloksykam jako potencjalny inhibitor glikacji – nowe zastosowanie znanego leku przeciwzapalnego

Starzenie się organizmu, zwane również senescencją, to fizjologiczny proces związany z pojawianiem się różnych dolegliwości. Jednym z kluczowych mechanizmów leżących u podstaw tego zjawiska jest teoria glikacji, która wskazuje na korelację między wiekiem a nagromadzeniem zaawansowanych produktów glikacji (AGEs). Produkty te przyczyniają się do postępującej utraty funkcji organizmu wraz z upływem czasu. AGEs powstają w wyniku nieenzymatycznej interakcji między węglowodanami (szczególnie grupą karbonylową) a białkami (głównie N-końcową lizyną i łańcuchem bocznym argininy). Ten post-translacyjny fenomen, znany jako reakcja Maillarda, zachodzi w każdej komórce organizmu, jednak glikacja nasila się w licznych stanach patologicznych, zwłaszcza podczas hiperglikemii. Badania wykazały, że AGEs przyczyniają się do pogorszenia funkcji poznawczych, problemów związanych z cukrzycą oraz nieprawidłowości w funkcjonowaniu nerek i wątroby.

Naukowcy od lat poszukują skutecznych inhibitorów glikacji. Pierwszym inhibitorem AGEs, który osiągnął pewien sukces, była aminoguanidyna – związek wychwytujący dikarbonylowe produkty pośrednie powstające podczas reakcji glikacji. Niestety, ze względu na niepożądane efekty uboczne, nie znalazła ona szerokiego zastosowania klinicznego. W obliczu tych ograniczeń, koncepcja repurposingu, czyli wykorzystania istniejących leków w nowych wskazaniach, stanowi obiecującą i ekonomiczną strategię wprowadzania nowych związków do procesu rozwoju leków.

Jak badania przedkliniczne wzmacniają potencjał meloksykamu?

Zespół naukowców postanowił zbadać potencjał meloksykamu (MEL) – powszechnie stosowanego niesteroidowego leku przeciwzapalnego (NLPZ) – jako środka przeciwdziałającego glikacji. Meloksykam zawiera pierścień tiazolowy, pięcioczłonowy aromatyczny związek heterocykliczny z atomami azotu i siarki, oraz cykliczną trzeciorzędową grupę sulfonamidową. Wcześniejsze badania wskazywały, że związki zawierające siarkę wykazują właściwości przeciwglikacyjne, potencjalnie działając poprzez aktywność antyoksydacyjną, wychwytywanie reaktywnych form karbonylowych oraz modulację szlaków zaangażowanych w powstawanie AGEs.

W badaniu wykorzystano szczury Wistar (150-200 g), które podzielono na sześć grup po 3 osobniki: kontrolną (otrzymującą 0,9% roztwór soli fizjologicznej), modelową (otrzymującą metylglioksal – MGO, 17,25 mg/kg), grupę pozytywnej kontroli (otrzymującą aminoguanidynę, 50 mg/kg) oraz trzy grupy otrzymujące meloksykam w różnych dawkach (0,15 mg/kg, 0,3 mg/kg i 0,6 mg/kg). Wszystkie substancje podawano dootrzewnowo przez 14 dni. Metylglioksal, związek posiadający dwie grupy karbonylowe, może modyfikować białka, szczególnie reszty lizyny i argininy, prowadząc do powstawania AGEs. Jego powstawanie przypisuje się glikolizie, metabolizmowi lipidów i metabolizmowi aminokwasów.

Po 14 dniach podawania substancji, przeprowadzono szereg testów oceniających funkcje poznawcze, parametry nerkowe i wątrobowe oraz ekspresję genów w tkankach wątroby, nerek i mózgu. “Nasze badanie miało na celu ocenę potencjału meloksykamu jako środka przeciwdziałającego szkodliwym efektom glikacji, która jest kluczowym mechanizmem w procesie starzenia i rozwoju wielu chorób przewlekłych” – wyjaśniają autorzy badania.

Wyniki testu labiryntu wodnego Morrisa (MWM) wykazały, że szczury otrzymujące MGO wykazywały znaczne deficyty w uczeniu się i pamięci przestrzennej, co objawiało się wydłużonym czasem dotarcia do platformy, krótszym czasem spędzonym w kwadrancie docelowym oraz zmniejszoną liczbą przepłynięć przez pozycję platformy w porównaniu z grupą kontrolną. Co istotne, zarówno aminoguanidyna, jak i meloksykam, szczególnie w niższych testowanych dawkach (0,15 i 0,3 mg/kg), łagodziły te zaburzenia poznawcze wywołane przez MGO.

Test MWM przeprowadzono w czarnym basenie o średnicy 180 cm i wysokości 50 cm, podzielonym na cztery równe sekcje. Czarna platforma umieszczona była w jednym z kwadrantów. Basen wypełniono wodą o temperaturze 25 ± 2°C. Na ścianach basenu umieszczono wyraźne wskazówki pomagające zwierzętom w lokalizacji platformy. Podczas sesji zapoznawczej pierwszego dnia platforma znajdowała się 1 cm nad powierzchnią wody. Przeprowadzono cztery próby, każda trwająca 120 sekund. W kolejnych sesjach treningowych (akwizycji) przeprowadzonych w ciągu następnych trzech dni, platformę stopniowo zanurzano pod powierzchnią wody. Piątego dnia platformę usunięto z basenu, aby ocenić utrzymywanie pamięci przestrzennej w próbie testowej. Zwierzęta miały 120 sekund na zlokalizowanie platformy.

Analiza wzorców nawigacyjnych ujawniła, że szczury z grupy kontrolnej poruszały się głównie w kwadrancie platformy, podczas gdy szczury z grupy modelowej wykazywały chaotyczny ruch w basenie MWM. Natomiast grupy otrzymujące leczenie (aminoguanidynę i meloksykam) wykazywały wzorzec nawigacji bardziej zbliżony do grupy kontrolnej. Czy oznacza to, że meloksykam może być skutecznym środkiem terapeutycznym w zaburzeniach poznawczych związanych ze stresem glikacyjnym?

Badanie wykazało również, że funkcje nerek i wątroby były zaburzone u szczurów otrzymujących MGO, co objawiało się podwyższonymi poziomami kreatyniny, ALP, SGOT i SGPT w porównaniu z grupą kontrolną. Zarówno aminoguanidyna, jak i meloksykam, szczególnie w niższych dawkach, chroniły funkcje nerek i wątroby przed szkodliwymi skutkami MGO. Do oceny funkcji nerek i wątroby pobrano krew poprzez nakłucie serca, którą następnie pozostawiono do koagulacji w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Surowicę uzyskano przez wirowanie przy 4250×g (około 3500 obr./min) przez 20 minut. Poziomy kreatyniny, SGPT, SGOT, ALP oraz bilirubiny bezpośredniej i całkowitej mierzono za pomocą analizatora chemii klinicznej (AU5800, Beckman Coulter, Niemcy).

Szczególnie interesujące wyniki uzyskano w analizie ekspresji genów, którą przeprowadzono metodą RT-qPCR. W tkankach wątroby szczurów otrzymujących MGO zaobserwowano znaczny wzrost ekspresji genów RAGE (receptor dla zaawansowanych produktów glikacji), TNF-α (czynnik martwicy nowotworów alfa) i Glyoxalase-1 w porównaniu z grupą kontrolną. “Aktywacja receptora RAGE prowadzi do fosforylacji ERK1/2, PI3-K/AKT, JAK2 i RhoGTPaz, co skutkuje stymulacją NF-κB i produkcją cytokin prozapalnych, takich jak TNF-α” – zauważają badacze. Jednak jednoczesne podawanie aminoguanidyny i meloksykamu znacznie osłabiało tę nadregulację genów.

Całkowite RNA z wątroby, nerek i mózgu ekstrahowano za pomocą odczynnika Trizol, a następnie przekształcano w cDNA (zestaw do syntezy cDNA, Thermo Scientific). Mieszanina reakcyjna (25 µl) została poddana cyklom termicznym w trzech etapach: denaturacja przez 10 minut w 95°C, następnie druga denaturacja przez 15 sekund w 95°C, przyłączanie starterów przez 30 sekund w 60°C i końcowe wydłużanie przez 30 sekund w 72°C. Te etapy denaturacji, przyłączania starterów i wydłużania powtarzano przez 40 cykli. Wykorzystano zestaw Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qPCR master mix (2X) z odpowiednimi starterami. Zmienność ekspresji genów między grupą kontrolną a grupami leczonymi określono za pomocą metody delta-delta progu cyklu (Ct).

W przypadku nerek, oprócz TNF-α i RAGE, oceniano również ekspresję VEGF (czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego). Badania wykazały, że MGO indukuje syntezę VEGF w komórkach śródbłonka i mezothelium, sprzyjając angiogenezie. W badaniu zaobserwowano znaczny wzrost ekspresji TNF-α, RAGE i VEGF w nerkach szczurów otrzymujących MGO w porównaniu z grupą kontrolną. Podawanie meloksykamu, podobnie jak aminoguanidyny, zmniejszało poziomy TNF-α, RAGE i VEGF w nerkach w porównaniu z grupą MGO, podkreślając jego potencjał jako środka terapeutycznego przeciwko uszkodzeniom nerek wywołanym przez MGO.

W mózgach szczurów otrzymujących MGO zaobserwowano znaczną nadekspresję RAGE, TNF-α i BACE (beta-sekretazy) w porównaniu z grupą kontrolną. Aktywność BACE była wcześniej związana z procesami neurodegeneracyjnymi indukowanymi przez MGO. Równoczesne leczenie aminoguanidyną i meloksykamem prowadziło do znacznego zmniejszenia ekspresji RAGE, TNF-α i BACE w porównaniu z grupą MGO, podkreślając ich skuteczność w łagodzeniu neuroinflammacji i produkcji β-amyloidu indukowanych przez MGO.

Badacze przeprowadzili również ilościową ocenę karboksymetylolizyny (CML), jednego z głównych AGEs, który jest związany z procesem starzenia i związanymi z nim chorobami. Dane wykazały znacznie podwyższony poziom CML w surowicy szczurów otrzymujących MGO. Zarówno aminoguanidyna, jak i meloksykam znacząco hamowały wzrost poziomu CML indukowany przez MGO. “Nasze wyniki sugerują, że ochronne działanie aminoguanidyny i meloksykamu w tym badaniu najprawdopodobniej wynikało z ich zdolności do hamowania glikacji” – podkreślają autorzy.

Do oznaczenia CML wykorzystano zestaw ELISA (CEB977Ge 96 Tests, Cloud Clone Corp, Chiny) zgodnie z protokołem producenta. Próbki testowe umieszczono na ramce płytki i nałożono 50 μl na każdą studzienkę. Płytkę przykryto membraną i inkubowano przez 30 minut. Po inkubacji studzienki dokładnie przepłukano 3-4 razy za pomocą pipety wielokanałowej, upewniając się, że nie doszło do zanieczyszczenia studzienek, a następnie pozostawiono do wyschnięcia. Następnie do każdej studzienki (z wyjątkiem ślepych prób) dodano 50 μl koniugatu peroksydazy chrzanowej (HRP) i inkubowano przez 30 minut. Następnie studzienki ponownie przepłukano i dodano roztwory chromogenu A i B (po 50 μl każdego). Membranę szczelnie zamknięto, a płytkę inkubowano przez dodatkowe 15 minut. Na koniec wprowadzono roztwór zatrzymujący, zmieniając kolor z niebieskiego na żółty. Odczyty absorbancji wykonano natychmiast przy 450 nm za pomocą spektrofotometru (Biotek Synergy HTX Multi-mode reader, Japonia).

Interesujące jest, że badanie histopatologiczne mózgu, nerek i wątroby nie wykazało żadnych zauważalnych zmian patologicznych w żadnej z grup leczonych w porównaniu z grupą kontrolną. Wątroba, mózg i nerki zostały wyekstrahowane, pocięte i zakonserwowane w 10% formalinie. Po odwodnieniu w wyższych stężeniach etanolu, organy oczyszczono w ksylenie i zatopiono w parafinie. Przygotowano cienkie skrawki o grubości 4 μm i zabarwiono H&E (hematoksyliną i eozyną). Do analizy zmian strukturalnych i morfologicznych w zidentyfikowanych komórkach z każdej tkanki użyto mikroskopu jasnego pola (Olympus U-MDOB3, Japonia).

Brak wykrywalnych zmian histologicznych sugeruje, że czas ekspozycji mógł być niewystarczający do wywołania znaczących zmian histologicznych. Zmiany histologiczne zwykle wymagają więcej czasu, aby się ujawnić. Jednak brak wyraźnych nieprawidłowości histologicznych nie oznacza braku zmian fizjologicznych lub biochemicznych.

Jakie kliniczne perspektywy niesie repurposing meloksykamu?

Badanie to ma istotne implikacje kliniczne. Meloksykam, obecnie stosowany jako NLPZ, może potencjalnie znaleźć nowe zastosowanie jako środek przeciwdziałający glikacji i jej konsekwencjom, w tym zaburzeniom poznawczym, uszkodzeniom nerek i wątroby. Jakie korzyści mogłoby przynieść stosowanie meloksykamu w profilaktyce i leczeniu chorób związanych z procesami starzenia i glikacją komórkową?

Wyniki badania wskazują na potencjalne mechanizmy działania meloksykamu: działanie antyoksydacyjne, wychwytywanie reaktywnych form karbonylowych i modulację szlaków zapalnych (zmniejszenie ekspresji RAGE i TNF-α), co przekłada się na ochronę przed glikacją indukowaną przez MGO. Co ciekawe, niższe dawki meloksykamu (0,15 i 0,3 mg/kg) wykazywały lepszą skuteczność niż wyższa dawka (0,6 mg/kg). Badacze sugerują, że przy wyższych dawkach nadmiar cząsteczek leku może konkurować o wiązanie lub ulegać samoasocjacji, potencjalnie zmniejszając ich dostępność do efektywnej interakcji z reaktywnymi formami karbonylowymi, co osłabia aktywność przeciwglikacyjną. Literatura wskazuje, że meloksykam może wykazywać zachowanie niezależne od stężenia. W niższych stężeniach okazał się bardziej skuteczny w niektórych badaniach niż w wyższych dawkach.

Dane w badaniu przedstawiono jako średnią ± SEM (n=3 na grupę). Do statystycznego porównania grup wykorzystano jednoczynnikową analizę wariancji ANOVA, wraz z analizą post-hoc (najmniejsza istotna różnica, LSD). Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania IBM SPSS (wersja 21.0, USA). P<0,05 służy jako minimalny poziom istotności.

Podsumowując, badanie to demonstruje, że meloksykam, powszechnie stosowany NLPZ, łagodził zaburzenia poznawcze, nerkowe i wątrobowe indukowane przez MGO u szczurów. W związku z tym stanowi potencjalną cząsteczkę wiodącą do repurposingu jako środek przeciwglikacyjny. Czy meloksykam znajdzie zastosowanie w profilaktyce i leczeniu chorób związanych z podwyższonym stresem glikacyjnym? Odpowiedź na to pytanie wymaga dalszych badań, w tym badań klinicznych, aby ocenić translacyjną wartość tych obserwacji z modelu przedklinicznego.

Wyniki te otwierają nowe perspektywy dla lekarzy pracujących w obszarach medycyny, farmakologii, neurologii, nefrologii, hepatologii i innych dziedzin medycznych, podkreślając potencjał istniejących leków w nowych zastosowaniach terapeutycznych.

Podsumowanie

Badania przedkliniczne wykazały, że meloksykam, powszechnie stosowany lek przeciwzapalny, może działać jako skuteczny inhibitor glikacji. W eksperymentach na szczurach Wistar stwierdzono, że meloksykam, szczególnie w niższych dawkach (0,15 i 0,3 mg/kg), łagodził zaburzenia poznawcze wywołane przez metylglioksal, co potwierdzono w teście labiryntu wodnego Morrisa. Lek wykazał również właściwości ochronne wobec funkcji nerek i wątroby, zmniejszając poziomy markerów uszkodzenia tych narządów. Analiza molekularna ujawniła, że meloksykam redukuje ekspresję genów związanych z procesami zapalnymi i glikacją, w tym RAGE, TNF-α i BACE, oraz obniża poziom karboksymetylolizyny w surowicy. Mechanizm działania meloksykamu opiera się na aktywności antyoksydacyjnej, wychwytywaniu reaktywnych form karbonylowych i modulacji szlaków zapalnych. Te odkrycia otwierają nowe perspektywy terapeutyczne w leczeniu chorób związanych ze starzeniem i stresem glikacyjnym.